一、實驗原理
Trizol的主要成分是苯酚，苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的核酸物質(zhì)得到釋放。同時苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。 0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。利用Trizol試劑處理的樣品加入氯仿后，經(jīng)離心樣品分成水樣層、中間層和有機層。RNA存在于水樣層中，收集水樣層后可以通過異丙醇沉淀RNA。
二、實驗試劑
Trizol試劑，DEPC，氯仿，異丙醇，DEPC處理水，75%的乙醇（DEPC水配制），植物乳桿菌05-19
三、實驗儀器
恒溫培養(yǎng)箱，常溫離心機，低溫離心機，移液器，電泳儀，電泳槽，紫外分析儀
四、操作步驟
接植物乳桿菌于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜備用。
取菌液2ml，12000rpm離心2分鐘，棄上清，加入1ml Trizol試劑，用槍吹吸，懸浮菌體，室溫放置十分鐘。
加入200ul氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈震蕩15秒，4℃12000rpm離心十分鐘。
取上清（大約500ul），加入等體積異丙醇，-20℃放置十分鐘，4℃12000rpm離心十分鐘。
棄去上清，加入1ml 75%乙醇，混勻，4℃12000rpm離心五分鐘。
小心棄去上清液，室溫干燥5-10min，注意不要過分干燥，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶解到15ul的DEPC處理水中。
進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將剩余RNA保存于-70℃。
實驗注意事項
整個操作要帶一次性口罩及手套，并盡可能低溫下操作。
加入氯仿后，首先混合均勻，吸取上清時，注意不要吸入中間層及有機相。
使用無RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染
配制溶液應(yīng)使用無RNase 的水。
公安機關(guān)備案號：
