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單克隆抗體提純實(shí)驗(yàn)制備流程

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上海藍(lán)基生物科技有限公司單克隆抗體提純實(shí)驗(yàn)制備流程
　1．材料   
     (1)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
　　20mMol/LNaCl
　　(2)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
　　40mMol/LNaCl
　　(3)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
　　80mMol/LNaCl
　　(4)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液
　　(5)飽和硫酸銨液
　　(6)DEAE—纖維素柱
　　2．操作方法
　?。?）小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后，于1.00×105轉(zhuǎn)離心30min，去沉淀。
　?。?）在4℃于上清中緩緩滴加飽和硫酸銨液，邊加邊攪拌，使溶液*終為50%硫酸銨濃度。
　　（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5000r/min離心10min，去上清。
　?。?）將沉淀溶于Tris－HCl緩沖液（40mMol/LNaCl）中（溶液可能混濁）。
　?。?）裝入透析袋于Tris－HCl緩沖液（20mMol/LNaCl）中透析除鹽。
　　（6）離心去沉淀。   
（7）溶液稀釋（1:100或更高倍稀釋）后，于280nm測(cè)蛋白含量，估計(jì)蛋白質(zhì)含量1A280unit=0.8mg蛋白質(zhì)一般每ml腹水中，含有總蛋白約25mg~36mg。
　?。?）過(guò)DEAE—纖維素柱：纖維素柱高40cm，以20mMol/LNaClTris緩沖液平衡。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋。
　　樣品進(jìn)入柱床速度為1ml~2ml/min，以NaCl線形梯度洗脫。大部分單克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脫，也有極少例外的單克隆抗體于120mMol/L~150mMol/LNaCl洗脫。測(cè)OD280nm收集蛋白峰，單克隆IgG保存?zhèn)溆谩?
　　雜交瘤產(chǎn)生各種**球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪種為主，則決定于抗原的**程序。**一次，且3天后就取脾，多為產(chǎn)生IgM的B**細(xì)胞。**多次的多為IgG。

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