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堿裂解法提取質(zhì)粒DNA

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點擊量： 161277 來源： 上海創(chuàng)賽科技有限公司
實驗?zāi)康?
1、掌握*常用的提取質(zhì)粒DNA的方法和檢測方法；
2、了解制備原理及各種試劑的作用。
 
實驗原理  堿裂解法是一種應(yīng)用*為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達到分離目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫DNA鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分離，當以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
    **質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細胞質(zhì)中、獨立于細胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細胞分裂傳遞到后代。
    質(zhì)粒已成為目前*常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA
一、材料
  含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌，1.5ml塑料離心管, 離心管架，槍頭及盒、衛(wèi)生紙。
二、設(shè)備
    微量移液器(20μl,200μl,1000μl)， 臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床， 高壓蒸汽**器(**鍋)， 渦旋振蕩器，恒溫水浴鍋，雙蒸水器，冰箱，等。
三、試劑準備
1、 LB液體培養(yǎng)基：稱取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml蒸餾水中，用NaOH調(diào)pH至7.5，加水至總體積1升，高壓下蒸氣**15分鐘。
2. 氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/div>
3. 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高壓**15min ，貯存于4℃。
4. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。
配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。
5. 溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。
配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/div>
6. 苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應(yīng)戴手套?！旧镄?www.bbioo.com】
7. 無水乙醇；
8. 70%乙醇；
9. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。121℃高壓濕熱**20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/div>
1M Tris Cl（Tris(三羥甲基)氨基甲烷）：800ml H2O中溶解 121g Tris堿，用濃鹽酸調(diào)pH值，混勻后加水到1L；
 0.5M EDTA（乙二胺四乙酸）：700ml H2O中溶解186.1g Na2EDTA.2H2O，用10M NaOH調(diào) pH8.0(需約50ml)， 補H2O到 1L。
10. RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5ml eppendorf管分裝成小份保存于-20℃。
 
四、操作步驟
1. 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20ml LB（含Amp100ug/ml）液體培養(yǎng)基中，37℃、250rmp振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）。
2. 取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中，12000rmp離心1-2min。棄上清，將離心管倒置于衛(wèi)生紙上，使液體盡可能流盡。
3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩，使菌體分散混勻。),室溫下放置5-10 min。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩)，冰浴5 min，使細胞膜裂解（溶液Ⅱ為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。
5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置5min。 12000rmp離心10min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。
6、上清液移入干凈eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻, 12000rmp離心10min。（450μl的苯酚/氯仿/異戊醇。）
7、小心移出上清于一新微量離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置 2-5min，離心12000rmp×10min。
8、棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp離心5 min。
9、 吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，室溫干燥。
10、將沉淀溶于20μl TE緩沖液(pH8.0，含20μg /ml RnaseA，約4μl)中，37℃水浴30min以降解RNA分子，儲于-20℃冰箱中?！?/div>
五 實驗結(jié)果：
 
注意事項
1. 提取過程應(yīng)盡量保持低溫。
2. 沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用異丙醇(一般使用等體積)，且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所以多數(shù)還是用乙醇。